En 1509 la reine Jeanne est arrivée à Tordesillas avec le cadavre de son époux, lequel a été déposé à Sainte-Claire. Treize ans après il a été transféré à Grenade. Elle est vecu enfermée à Tordesillas pendant 46 ans jusqu'à sa mort en 1555 à l'âge de 75 ans.
En 1517 Charles I, accompagné par sa soeur Éléonore, a visité sa mère pour la première fois dans le palais de Tordesillas. Ces visites se sont continuées tout au long des années, et la Cour s'est temporairement établie à Tordesillas. Ce même an, les funérailles solennelles par Philippe le Beau ont eu lieu.
Tordesillas a été scène de quelques événements dans la guerre des Communautés. Padilla a eu une entrevue avec Madame Jeanne le 29 août 1520, pour solliciter l'appui de la légitime souveraine à sa cause. La Sainte Assemblée s'y est rendue le 19 septembre 1520. Madame Jeanne a écouté ses réclamations, les a appuyées, mais n'a pas signé les décrets qu'on demandait qu'elle signe et qu'auraient servi à relever Charles, son fils, comme roi. Le 5 décembre 1520 les troupes du comte de Haro ont pris Tordesillas et le 23 avril 1521 les comuneros ont éssuyé leur défaite définitive à Villalar. Les blessés de cette bataille furent transférés à l'Hôpital de Mater Dei.
En 1525 l'Infante Catherine est sortie de Tordesillas pour se marier avec le roi portugais Jean III. La future reine et régente du Portugal a vécu à Tordesillas avec sa mère Jeanne I de Castille pendant presque 16 ans. Ce même an, les restes de Philippe le Beau sont déplacés à Grenade.
Vendredi Saint du 12 avril 1555 Reine Jeanne I de Castille est décédée à l'âge de 75 ans, après avoir vécu à Tordesillas pendant 46 ans.
En 1574 le corps de Jeanne est enterré dans une simple tombe dans le presbytérium de l'Église Conventuelle de Sainte-Claire. Après il est transféré à l'Escurial afin de le rendre postérieurement à la Chapelle Royale de Grenade, où ses restes reposent actuellement avec ceux de ses parents et son époux.
Tordesillas a été visité par Philippe II en 1592. Il y avait été déjà plusieurs fois quand il était prince et il y avait des dépendances privées dans le Palais Royal.
En 1603 l'ordre franciscain est arrivé à Tordesillas par désir de Philippe III.
Le grand débordement du Douro en 1636 a abîmé le pont médiéval.
