Por volta do ano de 1400, o monarca Enrique III manda construir um novo palácio nas proximidades do Convento de Santa Clara e do rio Douro.
Tordesilhas vai ganhando importância e é com os" Tratamaras" que conhece o seu maior auge histórico, celebrando-se em 1401 as Cortes de Tordesilhas, convocadas por Enrique III, o doente.
No ano de 1419 funda-se o Convento das Comendadoras de São João, por desejo de Juan II.
No ano de 1420, a corte do Rei D. Juan II de Castela, pai de Isabel, a Católica, estava em Tordesilhas no antigo palácio, agora desaparecido. O palácio é tomado pelo Infante Enrique de Antequera, prendendo Juan Hurtado de Mendoza, favorito do Rei e afastando-o do Governo. Consegue entrar nos aposentos do Rei. Tudo isto ocorreu devido à inimizade e ambições dos infantes de Aragão, que esperavam reger o reino de Castela em nome do seu primo Juan, que era ainda muito novo (15 anos), embora já tivesse sido declarado maior de idade (aos 14 anos).
Em 1423 Don Álvaro de Luna é nomeado governador de Tordesilhas e se celebram grandes festejos em sua honra.
Em 1430 a mãe dos Infantes de Aragão e sogra de Juan II, Leonor de Aragão, é presa e reclusa em Santa Clara.
Em 1434, Juan II volta a Tordesilhas, e o seu palácio converte-se na sua própria cadeia quando o Infante D. Fernando sequestra o Rei, repetindo um episódio que já antes havia realizado com o seu irmão Don Enrique. Esse mesmo ano funda-se o Convento dos Dominicanos.
Em 1439, reúnem-se as Cortes de Juan II e dos Infantes de Aragão, numa tentativa de estabelecer a paz entre as dua facções – o da Alta Nobreza, liderada pelos Infantes de Aragão; e a facção monárquica liderada pelo próprio Juan II e o Governador de Castela, Álvaro de Luna. Estes acontecimentos são vulgarmente conhecidos como a assinatura do "seguro de Tordesilhas", sob visionamento do Conde de Haro.
Durante o reinado de Juan II, pouco tempo depois de se ter casado com a segunda mulher, Isabel de Portugal, mulher de temperamento ciumento e de ira; esta ordena a prisão de Beatriz da Silva, primeira mulher do rei, no interior de um baú durante três dias. Durante a sua enclausura tem uma visão da Virgem, que lhe pede para fundar uma ordem em sua honra; a ordem da Puríssima Concepção. Foi canonizada em 1976 pelo Papa Paulo VI.
Em 1451, Juan II e o seu filho Infante Enrique, futuro Enrique IV, o Impotente, reúnem-se em Santa Clara para tratar de encontrar um entendimento, uma vez que este se havia perdido ao estarem em facções opostas.
Em 1453, nasce em Tordesilhas o Infante Alfonso, filho de Juan II e de Isabel de Portugal, que haveria de ser nomeado mais tarde como herdeiro do Trono de Castela, pelo seu meio irmão Enrique IV.
Em 1465, Enrique IV concede alguns privilégios a Tordesilhas, tais como o mercado Franco, que se deveria realizar às terças-feiras, dia que ainda hoje se mantém.
Em 1467, funda-se o Hospital de Mater Dei, graças à doação feita por D. Beatriz, filha de D. Dinis de Portugal.
Em 1468, produz-se a Concórdia dos Touros de Guisando, na qual Isabel, a Católica, é reconhecida como herdeira do trono pelo seu irmão, o Rei; pressionado pela Nobreza que assegura que Joana, filha única de Enrique IV, é filha bastarda de Beltrán de la Cueva, homem de confiança do Rei. No entanto, para que tal aconteça, Isabel terá de se casar com ele.
Em 1474 morre Enrique IV, produzindo-se então uma Guerra Civil entre os partidários de Joana, "La Beltraneja", apoiada pelo seu marido Afonso V de Portugal, e os partidários de Isabel, a Católica, apoiada pelo seu marido. Fernando, o Católico, é chamado pelo povo de Tordesilhas, pois o Governador de Castronunho, que apoiava Joana, "La Beltraneja", tinha-se apoderado da vila saqueando-a. O Hospital de Mater Dei é convertido no seu forte, porque a sua fundadora é portuguesa, e apoderam-se das rendas e das colheitas. Posteriormente, Tordesilhas é libertada e convertida em quartel General das tropas dos Reis Católicos. Desde aqui saiem as tropas comandadas por Fernando, o Católico, para a batalha de Toro (1476), cuja vitória é decisiva ara o rumo da guerra.
Em 1479 assina-se o Tratado de Alcaçovas, tratado de paz entre as coroas Castelhana e Portuguesa, pelo que se reclusa Joana num convento em Coimbra e se combina o casamento entre a primogénita dos Reis Católicos e o Infante Afonso de Portugal. Neste tratado, ambas coroas dividem o Oceano Atlântico. Seria, portanto, o tratado antecessor ao Tratado de Tordesilhas.
Em 1485, o Bispo de Segóvia, Juan Árias Dávila, ordena a abertura de uma praça pública digna da vila, e edificar uma Casa Consistorial, dando assim traçado à actual Praça Maior.
Em 1494 produz-se um dos acontecimentos mais importantes da história de Tordesilhas. Neste ano assina-se o Tratado de Tordesilhas a 7 de Junho, no qual a coroa Castelhana e Portuguesa repartem s direitos de navegação e conquista do Atlântico.
Em 1499 funda-se o Hospital de Peregrinos, graças à vontade expressa no testamento de D. Juan Gonzalez, Arceispo da vila.
