Em 1509, chega a Rainha Juana I a Trdesilhas com o cadáver do seu marido, o qual é enterrado em Santa Clara durante treze anos, até que é trasladado para Granada. A Rainha viverá reclusa nesta localidade durante 46 aos, até que morre no ano de 1555 com a idade de 75 aos.
Em 1517, Carlos I, acompanhado de sua irmã Leonor, visita pela primeira vez a sua mãe no Palácio de Tordesilhas, visitas que se manterão ao longo dos anos, estabelecendo-se a Corte temporariamente em Tordesilhas. Ainda esse ano se celebram os funerais solenes por Felipe, o Formoso.
Tordesilhas foi cenário de alguns acontecimentos da Guerra das Comunidades. Padilla reuniu-se com D. Joana, a 29 de Agosto de 1520 para solicitar o apoio da única e legítima soberana a favor da sua causa. Para esta vila se modou a Santa Junta a 19 de Setembro de 1520. D. Joana escutou-os, apoio-os, mas não assinou os decretos que eles pediam, e que serviriam para destituir D. Carlos, seu filho, como Rei. A 5 de Dezembro de 1520 as tropas de Conde Haro tomam Tordesilhas e a 23 de Abril do ano de 1521 os Comuneiros sofrem a sua defenitiva derrota emVillalar, sendo os feridos de dita batalha transportados para o Hospital de Mater Dei.
Em 1525 a Infanta Catalina deixa Tordesilhas para se casar com o rei português João III, pelo que, a que foi Rainha e Regente de Portugal, viveu em Tordesilhas junto de sua mãe Joana III de Castela durante quase 16 anos. Neste ano, mudam-se os restos mortais de Felipe, o Formoso, para Granada.
No dia 12 de Abril, sexta-feira Santa, do ano de 1555, dá-se o falecimento da Rainha Joana I de Castela, com a idade de 75 anos, isto depois de ter estado reclusa em Tordesilhas durante 46 anos.
Em 1574, o corpo de D. Juana, sepultado numa simples fossa na sacristia da igreja do Convento de Santa Clara, é trasladado para o Escorial, para posteriormente ser mudada para a Capela Real de Granada, aonde actualmente descansam os seus restos mortais junto aos dos seus pais e marido.
Tordesilhas foi visitada por Felipe II em 1592, local aonde já tinha estado várias vezes ainda como Príncipe, e aonde possuia uns aposentos privados no Palácio Real.
Em 1603, a Ordem Franciscana chega a Tordesilhas por desejo de Felipe III.
Em 1636 a ponte medieval ficou bastante danificada devido ao transbordar do rio Douro, que se produziu nesta época.
